|
文案介绍
2023年10月，上海交通大学医学院附庸瑞金医院科研团队在期刊Redox Biology（IF:11.3997）发布了一篇题为“Cancer-associated fibroblasts impair the cytotoxic function of NK cells in gastric cancer by inducing ferroptosis via iron regulation”的文案。
#1
科研背景
Bac公斤round
做为肿瘤微环境（TME）中最重点的免疫控制成份，癌关联成纤维细胞（CAFs）会控制自然杀伤细胞（NK细胞）的活性，从而促进肿瘤发展和免疫逃逸。科研发掘，在人类胃癌中，NK细胞水平与CAFs数量成反比。在一个源自人类病人衍生的类器官模型中，联合运用去铁胺和FSTL1-中和抗体对CAFs进行功能性靶向，可明显缓解CAF诱导的NK细胞铁吞噬功效，并加强NK细胞对GC的细胞毒性。这项科研证明了TME中的CAF控制NK细胞活性的新机制，并为加强NK细胞介导的抗GC免疫反应供给了一种潜在的治疗办法。
#2
科研办法
Methods
重点包含创立胃癌细胞球（PDOs）与癌关联成纤维细胞（CAFs）和自然杀伤细胞（NK细胞）的共培养模型，经过流式细胞术和荧光显微镜等技术评定CAR-NK92细胞的效力，以及运用Trizol试剂提取总RNA并进行定量实时PCR（qRT-PCR）、Western blotting和酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术分析关联蛋白和细胞因子的表达水平。另外，科研人员还运用ImageJ软件对荧光显微镜图像进行分析，并运用学生t检验和Pearson关联性分析等办法对数据进行统计分析。
#3
重点结果
Results
CAF 与人类 GC 中的 NK 细胞水平成反比，并在体外控制 NK 细胞的活力和细胞毒性
科研人员经过分析TCGA数据库和21对GC组织样本的免疫荧光染色结果发掘，CAFs的丰度与NK细胞水平呈负关联。另外，科研人员还运用DELIFA EuTDA细胞毒性分析和CCK8细胞活力分析等技术，证明CAFs能够明显控制NK细胞对GC细胞的细胞毒性和活力。
图1 在人类胃癌中，CAFs 的水平与 NK 细胞的水平成反比，并在体外控制 NK 细胞的活力和细胞毒性。
A，按照 TCGA 数据库，GC 组织中免疫细胞与 CAFs 的关联性。B-C，GC 肿瘤组织中 α-SMA 和 CD56 的表率性免疫荧光染色以及 21 例 GC 肿瘤组织中 α-SMA 和 CD56 的关联性。箭头暗示CD56的表达。D，经过荧光强度测定 NFs 和 CAFs 诱导的 pb-NK 细胞（用 Calcein-AM 标记）的趋化性。E、流式细胞术评定单独培养（BLANK）或与 CAFs 一起培养的 NK92 细胞的细胞死亡状况。F-G，经过 CCK8 检测与 CAFs 一起培养的 NK92/pb-NK 细胞的增殖状况。H-I，用酶联免疫吸附法测定与 CAFs 一起培养的 NK92/pb-NK 细胞分泌的 TNF-a 和 IFN-y 蛋白水平。J-M，经过 DELFIA EuTDA 细胞毒性实验测定 CAFs对 SNU16 和 MKN45 GC 细胞的NK92 和 pb-NK 细胞毒性的影响。数据表率最少三个独立实验的结果。数据分析采用学生 t 检验和pearson关联分析（均值 ± SD；*P < 0.05，**P < 0.01）。
CAFs 经过促进细胞内铁过载诱导 NK 细胞铁死亡
科研人员运用CCK8细胞活力分析和荧光显微镜等技术，证明CAFs可以明显控制NK细胞的活力和细胞增殖，并且经过铁超载诱导NK细胞的死亡。另外，科研人员还运用定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting等技术，证明CAFs能够经过调节铁代谢关联基因和蛋白的表达来促进NK细胞的铁超载。
图2 CAFs 经过促进 NK 细胞内铁过载诱导铁死亡。
A、在特定控制剂 Z-VAD（caspase-3 控制剂）、Nec1（坏死控制剂）或 Fer1（铁败坏控制剂）存在下 48 h，用 CCK8 检测与 CAFs 一起培养的 NK92 细胞的活力。B-C，经过 DELFIA EuTDA 细胞毒性测定（Fer1 5 μM、Lip1 50 nM）检测CAFs 对 MKN45 和 SNU16 GC 细胞的 NK92 和 pb-NK 细胞毒性的影响。D-E，运用 C11 BODYPI 581/591 探针检测与 CAFs 一起培养的 NK92 细胞中的脂质 ROS水平。用 0.5 μM RSL3 处理 48 h的 NK92 细胞做为阳性对照（比例尺 = 20 ㎛）。F，运用 MDA 检测试剂盒检测与 CAFs 一起培养的 NK92 细胞中的 MDA水平。用 0.5 μM RSL3 处理 48 h的 NK92 细胞做为阳性对照。G，用透射电镜分析 pb-NK 细胞的线粒体（比例尺 = 1μm/500 nm）。H-I，在未处理的细胞或与 CAFs（+CAFs）共培养的细胞中，经过Fe2+检测探针检测 pb-NK 细胞中的亚铁（比例尺 = 20 ㎛）。J，在无或有 DFO（10 μM，48 h）的状况下与 CAFs 共培养后，经过Fe2+检测探针检测未处理细胞中 NK92 细胞的亚铁含量。K，用 C11 BODYPI 581/591 探针检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFO（10 μM）共培养的 NK92 细胞中的脂质 ROS水平。L，经过 MDA 检测法检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFO（10 μM）共培养的 NK92 细胞中的 MDA水平。M，经过 ELISA 检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFO（10 μM）共培养的 NK92 细胞中的 4-HNE水平。数据表率最少三个独立实验的结果。数据分析采用学生 t 检验（均值 ± SD；*P < 0.05，**P < 0.01）。
CAFs 经过将铁导出到 TME 来加强 NK 细胞铁不稳定水平
科研人员运用定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting等技术，证明CAFs相针对正常成纤维细胞（NFs）拥有更高的铁导出蛋白（ferroportin1和hephaestin）和铁储存蛋白（ferritin）的表达水平，并且在CAFs中观察到更高的总铁含量。另外，科研人员还运用Calcein-AM染色和荧光显微镜等技术，证明CAFs能够将铁导出到TME中，并且经过调节铁代谢关联基因和蛋白的表达来加强NK细胞铁不稳定水平。
图3 CAFs 经过将铁导出到 TME 来加强 NK 细胞的铁不稳定水平。
A-B，经过 QRT-PCR 分析三对正常成纤维细胞（NFs）和 CAFs 中的α-蛋白（HEPH）和铁蛋白 1（FPN1）的 mRNA 水平。C、经过 Western 印迹分析 NFs 与 CAFs 中 FTH、FTL、FPN1 和 HEPH 的蛋白表达。D-E，经过Calcein-AM染色检测NFs和CAFs中的铁离子（比例尺=100㎛）。F-G，用指定剂量的 DFP（0-100 μM，48 h）处理后，用 Calcein-AM 染色法检测 CAFs 中的铁离子（比例尺 = 100 ㎛）。H，Calcein-AM 检测去除 DFP 后 CAFs 中铁离子的变化。I，用Calcein-AM检测与 NK92 共培养的仅 CAFs 或 CAFs 加 DFP 中的铁离子水平。J，经过 CCK8 检测法（Fer1:5 μM）测定仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFP 共培养的 NK92 细胞的活力。K，仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFP（100 μM）共培养的 NK92 细胞中的亚铁含量经过Calcein-AM检测。用荧光酶标仪测定。L，用 C11 BODYPI 581/591 探针检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFP（100 μM）共培养的 NK92 细胞中的脂质 ROS水平。M，经过 MDA 检测法检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFP（100 μM）共培养的 NK92 细胞中的 MDA水平。N，经过 ELISA 检测仅与 CAFs 或 CAFs 加 DFP（100 μM）共培养的 NK92 细胞中的 4-HNE水平。数据表率最少三个独立实验的结果。数据分析采用学生 t 检验（均值 ± SD；*P < 0.05，**P < 0.01）。
依赖 NCOA4 的噬铁蛋白介导 NK 细胞中 CAF 诱导的细胞内铁过载
科研人员运用Western blotting等技术，证明CAFs能够明显增多NK细胞中铁代谢关联蛋白（转铁蛋白受体、铁导出蛋白1、重链和轻链的铁蛋白）的表达水平，并且经过调节NCOA4的表达来促进NK细胞中铁蛋白的降解。另外，科研人员还运用荧光显微镜等技术，证明CAFs能够经过NCOA4介导的噬铁蛋白功效来诱导NK细胞中的铁过载。
图4 经过 NCOA4 进行的铁蛋白吞噬参与了 CAF 诱导的 NK 细胞内铁过载。
A、经过 Western 印迹分析 pb-NK 和 NK92 细胞与 FAS（100 μM）培养后 TfR、FPN1、FTL 和 FTH 的蛋白表达。B-C，pb-NK和NK92细胞与CAFs、CAFs与DFO（10 μM）或DFP（100 μM）预处理的CAFs共培养后TfR、FPN1、FTL和FTH的Western印迹分析。D，经过 QRT-PCR 分析与 CAFs 共培养后 NK92 细胞中与铁蛋白调节关联的基因的 mRNA 水平。E，与 CAFs 共培养的 NK92 细胞中 NCOA4 和 FTH 的 Western 印迹。F、与 CAFs 一起培养的 NK92siNC 或 NK92siNCOA4 细胞中 NCOA4 和 FTH 的 Western 印迹分析。G，经过 CCK8 检测法（Fer1 5 μM）测定与 CAFs 一起培养的 NK92siNC 或 NK92siNCOA4 的活力。H，Calcein-AM染色检测有或没 CAFs 培养的 NK92siNC 或 NK92siNCOA4 中的亚铁含量。I，用 C11 BODYPI 581/591 探针检测脂质 ROS水平。J，经过 MDA 检测法检测 MDA水平。数据表率最少三个独立实验的结果。数据分析采用学生 t 检验（均值 ± SD；*P < 0.05，**P < 0.01）。
CAF 衍生的 FSTL1 经过 DIP2A-P38 通路上调 NK 细胞中 NCOA4 的表达
科研人员运用定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting等技术，证明FSTL1在CAFs中高表达，并且能够明显增多NK细胞中NCOA4的表达水平。另外，科研人员还运用shRNA和rhFSTL1等技术，证明FSTL1能够经过DIP2A-P38通路来调节NK细胞中NCOA4的表达。详细来讲，FSTL1的过表达能够激活NK细胞中的P38通路，从而上调NCOA4的表达；而FSTL1的沉默能够控制NK细胞中的P38通路，从而下调NCOA4的表达。
图5 CAF 衍生的 FSTL1 可经过 DIP2A-P38 通路上调 NK 细胞中 NCOA4 的表达。
A、TCGA 数据库中 NCOA4 和 FSTL1 在 GC 中表达的关联性。B、经过 ELISA 分析 NK 细胞（pb-NK、NK92）、GC 细胞系（MKN-45、N87、SNU5、SNU16 和 AGS）和配对的 GC 病人 NF 和 CAF 细胞上清液中的 FSTL1 含量。C、经过 QRT-PCR 分析经 rhFSTL1（20 ng/mL）处理 48 h的 NK92 细胞中 NCOA4 的 mRNA 水平。D、用 Western 印迹法分析经 rhFSTL1（20 ng/mL；48 h）处理的 NK92 细胞中 NCOA4 和 FTH 的蛋白表达。E、经过Calcein-AM染色检测接受或不接受 rhFSTL1（20 ng/mL；48 h）处理的 NK92 细胞中的亚铁含量。F、经过蛋白印迹分析与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养 48 h的 NK92 细胞中 NCOA4 和 FTH 的蛋白表达。G, 经过Calcein-AM染色检测与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养 48 h的 NK92 细胞中的亚铁含量。H, 运用 C11 BODYPI 581/591 探针检测与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养的 NK92 细胞中的脂质 ROS水平。I、经过 MDA 检测法检测与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养的 NK92 细胞中的 MDA水平。J, 酶联免疫吸附法检测与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养的 NK92 细胞中的 4-HNE水平。K、经过蛋白印迹分析经 rhFSTL1（20 ng/mL；48 h）处理的 NK92siDIP2A 或对照细胞中 NCOA4 的蛋白表达。L，经过蛋白印迹分析与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养的 NK92 细胞中 p-p38 和 p38 的蛋白表达。M，经过蛋白印迹分析经 rhFSTL1（20 ng/mL；48 h）处理的 NK92siDIP2A 或对照细胞中 p-p38 和 p38 的蛋白表达。N，经过蛋白印迹分析经 rhFSTL1（20 ng/mL）或 p38 控制剂（p38-MAPK-in-1 20 μM）处理的 NK92 细胞中 p-p38、p38 和 NCOA4 的蛋白表达。O、经过蛋白印迹分析与 CAFs-shFSTL1 或 CAFs-shNC 一起培养的 pb-NK 细胞中 DIP2A、p-p38、p38、NCOA4 和 FTH 的蛋白表达。数据表率最少三个独立实验的结果。数据分析采用学生 t 检验和pearson关联分析（均值 ± SD；*P < 0.05，**P < 0.01）。
另外，联合应用 DFO 和 FSTL1-neutralizing 抗体可减轻 CAF 诱导的 NK 细胞铁死亡，并加强 CAR-NK 对 GC 的细胞毒性。
图6 联合应用 DFO 和 FSTL1-neutralizing 抗体可减轻 CAF 诱导的 NK 细胞铁死亡，并加强 NK 细胞对 GC 的细胞毒性。
A, 经过Calcein-AM染色检测与含有或不含 FSTL1-neutralizing antibody (FnAB, 1 μg/mL) 和/或 DFO (10 μM) 的 CAFs 一起培养的 NK92 细胞中的亚铁含量。B，用 C11 BODYPI 581/591 探针检测与 CAFs 一起培养的 NK92 细胞中含有或不含 FnAB（1 μg/mL）和 DFO（10 μM）的脂质 ROS水平。C，经过 MDA 检测法检测 NK92 细胞与 CAFs 一起培养时加入或不加入 FSTL1-neutralizing antibody（FnAB，1 μg/mL）和 DFO（10 μM）的MDA水平。D，用 ELISA 法检测 NK92 细胞与含有或不含 FSTL1-neutralizing antibody (FnAB, 1 μg/mL) 和 DFO (10 μM) 的 CAFs 一起培养时的 4-HNE 含量。E，用流式细胞术分析 NK92 细胞与含有或不含 FnAB (1 μg/mL) 和 DFO (10 μM) 的 CAFs 一起培养时的细胞死亡状况。F-G，用 DELFIA EuTDA 细胞细胞毒性测定法检测 NK92 细胞和 pb-NK 与含有或不含 FnAB （1 μg/mL）和 DFO （10 μM ）的 CAFs 一起培养后对 MKN45 和 SNU16 GC 细胞的细胞毒性。H，经过Western印迹分析MSLN在GC类器官（PDO1T和PDO3T）和GC细胞（MKN45和SNU16）中的蛋白表达。I，流式细胞术分析了 PDO1T 与 NK92 或 CAR-NK 细胞（PDO1T: NK92 或 CAR-NK = 1:5）共培养的细胞死亡状况。J-K，在 DFO/FnAB 和/或 CAR-NK 细胞（PDO1T: CAFs: NK = 1:2:5，DFO: 10 μM，FnAB: 1 μg/mL）存在下，经过流式细胞术分析 PDO1T 与 CAFs 一起培养的细胞死亡状况。L-M 在 DFO/FnAB 和/或 CAR-NK 细胞（PDO1T: CAFs: NK = 1:2:5，DFO: 10 μM，FnAB: 1 μg/mL）存在下，用Calcein-AM染色检测分析 PDO3T 与 CAFs 共培养的细胞死亡状况（比例尺 = 20㎛）。数据以三个独立实验的平均值 ± SD 暗示。数据分析采用学生 t 检验（*P < 0.05；**P < 0.01）。(相关本图例中颜色参考文献的解释，请读者参阅本文的网络版）。
图7 CAFs 在 GC 中诱导 NK 细胞铁死亡的可能机制示意图。
CAFs 增多了 NK 细胞内的铁不稳定，经过将铁导出到 TME 来诱导铁死亡，同期还诱导 FSTL1-NCOA4 介导的 GC 铁蛋白自噬。因此呢，经过克服肿瘤基质的免疫控制，结合 FSTL1 中和抗体和 DFO 治疗可能是治疗 GC 的一种有前景的治疗策略。
#4
总结
Suggestion
此项科研为认识 GC 中 CAFs 和 NK 细胞之间的相互功效供给了宝贵的见解。CAFs 增多了 NK 细胞内的铁不稳定，经过将铁输出到 TME 和促进 FSTL1-NCOA4 介导的噬铁蛋白诱导铁嗜酸性粒细胞增加。结果发掘强调了靶向这些通路做为一种治疗策略来加强 NK 细胞对 GC 的免疫反应的潜能。然而，为了认识TME中CAFs和免疫细胞之间错综繁杂的相互功效，并探讨这些发掘对治疗GC的临床道理，还必须进一步的科研。
参考信息
Cancer-associated fibroblasts impair the cytotoxic function of NK cells in gastric cancer by inducing ferroptosis via iron regulation.Redox Biol. 2023 Nov:67:102923. doi: 10.1016/j.redox.2023.102923.PMID: 37832398 PMCID: PMC10582581.
往期举荐
胃癌类器官培养图鉴
【Nature Protocols】系列：怎样培养血管类器官（上）
“类器官”斩获国自然重点项目，首例视网膜类器官移植开创再生医学行业新篇章！
国自然基金-类器官项目申报思路解析（含2023年获准项目实例！）
【国际专访】Jiang教授：类器官模型不会取代身体模型，但有助于简化药品研发返回外链论坛：http://www.fok120.com/，查看更加多
责任编辑：网友投稿
| 
发表于 2024-6-27 11:23:07
