1 | 前言介绍
在过去的十年里，基于荧光的影像技术在医学诊断中取得了重大发展，尤其是外源近红外（NIR）荧光染料的运用，这些染料能够加强这些设备收集的信息。近红外激发和发射波长（690nm~1000nm）表率了一个区域，在该区域内源组织荧光较低，光穿透性相对较高，由于水、黑色素、氧和去氧血红蛋白的吸收较低。
NIR荧光影像已被广泛应用于转移影像、淋巴结识别、术中肿瘤描绘和血管映射等应用中。尽管NIR影像技术在临床改善方面展现了巨大潜能，但在设备性能的客观、定量表征方面仍然缺乏标准化的测试办法。
经过验证的组织模拟模型能够在设备生命周期的各个周期（如初期系统研发、设备优化和比较、临床实验标准化、监管准许、制造质量掌控、重新校准、临床一致性测试和临床大夫培训）中促进各样性能评定任务。日前，有许多国际共识文件描述了磁共振影像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和PET等已创立的医学影像模式的标准化模型测试办法。然而，针对光学影像模式（如NIR荧光影像）还无等效的文件。因此呢，需要确定一组最佳的性能指标，这些指标应是客观的、定量的、科学严谨的，同期对用户的包袱最小。
2 | 材料与办法
近红外荧光（NIRF）影像系统
本文中运用的所有图像均由定制的桌面NIRF影像系统获取。该系统运用一个中心波长为780nm、带宽为30nm的发光二极管（LED）做为照明光源，样品表面的辐照度为2mw/cm²。为了加强照明的均匀性，系统中运用了一个凸透镜和一个扩散器。800nm的短通滤光片用于减少检测到来自LED的激发光的可能性。相机配备了一个截止波长为825nm的长通滤光片。荧光图像由一台16位的CCD相机捕捉，相机安装在一个带有125mm长行程齿条和小齿轮轨道的支架上，以便垂直移动相机。相机图像经过Micro Manager软件获取，并运用ImageJ进行后处理。
定制近红外荧光影像系统的示意图
模型制作
咱们研发了三种类型的组织模拟模型，用于性能测试，运用ICG做为荧光剂。ICG是一种水溶性染料，在780nm周边有宽吸收峰，发射峰接近800nm。因为其光学特性和生物相容性，ICG作为临床影像生物结构（如血管和导管）的常用荧光剂。
在荧光模型制作之前，用于多孔板和广域模型的材料进行了校准，以模拟组织散射（µs’= 10cm−1）。为了达到这一目的，咱们运用区别浓度的二氧化钛（TiO2）制备了1mm厚的薄板模型。每一个环氧树脂模型按制造商的标准协议制备，按重量混合1:1的比例（树脂：硬化剂）。混合物搅拌10分钟后，置于低压下以去除气泡，而后静置24小时固化。用UV-VIS分光光度计测绘薄板的漫反射和透射，并运用反向叠加加倍技术估算模型的光学特性。
多孔模型
多孔模型运用13种区别浓度的ICG制备，从0.008µM到52µM不等。每一个样品包含ICG、TiO2（7.4mM）、树脂和硬化剂。制备模型的协议与前述类似。混合物在一个96孔黑色微孔板中固化。该模型用于表征系统的灵敏度、线性和激发光串扰。
宽视场模型
一种均匀的ICG掺杂浑浊模型用于表征空间分辨率、景深、信号线性、FOV和均匀性。该模型的制备配方和实验协议与前述类似。针对这种宽视场模型，ICG浓度为32.3µM，TiO2浓度为152mM，总体积为30mL。最后混合物经超声处理后倒入3"×6"×1.17"的模具中固化。
多通道模型
第三种模型基于咱们之前在3D打印模型制作方面的工作。模型在SolidWorks中设计，并运用Polyjet打印机打印，材料为专有的紫外固化光聚合物。模型运用白色材料打印，模拟组织散射特性。利用分光光度计和反向叠加加倍软件测绘并估算其在820nm的吸收和散射系数分别为0.015mm−1和0.52mm−1。为了避免信号串扰，在通道之间打印了高度吸收的黑色材料。每一个通道直径为2mm，模型的总尺寸为6.5cm×3cm×3cm。ICG（3.2µM）与人血清白蛋白（7.25µM）溶解在PBS中，并注入通道内以产生荧光对比。该模型用于评定NIRF影像系统的穿透深度灵敏度。
3D打印的多通道模型用于穿透深度测绘
模型表征
液态和固态ICG模型的荧光发射光谱运用分光荧光光度计（PTI QuantaMaster QM4, Horiba Scientific, Piscataway, NJ）测绘。两种样品的ICG浓度均为3.2 µM。液态模型在固化时其发射峰出现了大约20纳米的蓝移（从820nm到800nm）。ICG在区别溶剂中能够产生区别的光谱特性。因为ICG属于碳菁染料类，其会按照浓度和溶剂的性质形成聚集体。
荧光素的光漂白会对标准化测试产生有害影响。因此呢，评定了光稳定性以保证模型在一段时间内产生一致的荧光发射。多孔模型中最高浓度的ICG（3.2µM）在740µW/cm²、6mW/cm²和12mW/cm²的辐照度下影像。结果显示，在两个较低强度水平下拥有高度稳定性，而在12mW/cm²的状况下，30分钟内信号减少了近10%。
长时间信号变化是掺荧光染料聚合物模型的一个已知问题，可能会限制其运用寿命。为了评定稳定性，构建了两种类型的环氧树脂模型：
（a）多孔模型（3.2µM ICG）
（b）均质浑浊模型（32.3µM ICG）
两种模型的荧光强度运用近红外荧光影像系统每周记录一次，连续八周。多孔环氧树脂模型的强度下降了约7%，而均质模型的强度下降了约10%。两个模型在大约一月内表现出高稳定性，之后荧光强度起始下降。
图像质量特性
◈ 空间分辨率
影像系统的空间分辨率（或清晰度）是评定系统解析细微结构能力的重要图像质量特性。用于确定空间分辨率的办法多种多样，并在白光影像系统（如内窥镜）中得到了很好的创立。国际标准化组织（ISO）的内窥镜标准举荐运用条形图分辨率目的（如USAF 1951目的）在中心和四个离轴位置识别水平和垂直方向的分辨率。
在本文中，采用了一种标准条形图办法，将负片目的（USAF 1951铬玻璃）安置在宽视场荧光模型上。运用780nm的LED光源照亮目的，并计算对比转移函数（CTF）：
为水平和垂直方向生成为了一个CTF曲线。
1951 年分辨率测试目的，负片，玻璃上镀铬（位置于宽视场荧光模型之上）
◈ 景深（DOF）
NIRF成像器的景深（DOF）针对理解图像质量怎样受到相机-目的间距和非平面组织表面的影响非常重要。经过在一系列相机到目的工作距离上进行空间分辨率测绘来确定景深。为垂直和水平方向生成为了CTF曲线。咱们基于以下三个指标来科研景深：
(a) Rayleigh准则
(b) 三阶多项式拟合
(c) 空间频率为2 lp/mm时的对比度
第1种办法触及经过线性插值确定在每一个工作距离上对比度达到26.4%的空间频率。针对第二种办法，运用三阶多项式拟合CTF函数并确定分辨率。鉴于确定CTF曲线可能耗时且过于仔细，采用了一种更简单的办法，即将单一空间频率（在最佳焦点位置拥有中等高对比度的2 lp/mm）的对比度做为工作距离的函数进行确定。
◈ 灵敏度
文献中有许多科研运用产生多种荧光强度水平的样品来评定灵敏度和信号线性。大都数状况下，运用供给一系列荧光剂浓度的多样品模型来评定影像系统的灵敏度。这些模型应供给生物学上关联的浊度以及类似于身体测绘时的量子产率水平和光谱特性，以优化测试结果的临床关联性。
本科研运用掺杂ICG的多孔模型进行测试。每一个模型图像经过平场校正进行处理，以校正样品的非均匀照明，运用以下关系：
其中，I1=实验图像；I2=参考图像；k=实验图像的平均荧光强度。
而后，计算了最大强度位置中心直径为50像素的圆形区域的平均荧光强度。信噪比（SNR）经过测绘无荧光染料浓度的孔做为平均背景值（SB），平均荧光强度（SI）和背景孔的标准偏差（σ(SB)）来计算。而后运用以下关系计算SNR：
◈ 检测限和定量限
灵敏度最重要的方面之一是特定荧光剂在特定影像系统中的检测限。按照国际标准化组织（ICH）指南，检测限（LOD）定义为SNR=3时的浓度，定量限（LOQ）定义为SNR=10时的浓度。咱们在分析中遵循这些定义。以前的研究在肽分析中运用这种技术来确定各样系统的LOD和LOQ。
◈ 信号线性
信号线性是保证所获取数据准确表率影像场景的关键特征，并且能够将高强度的局部特征（例如肿瘤）与背景进行最佳区分。最常用的办法是运用多孔模型，经过拟合荧光染料浓度与测绘强度的关系图来量化线性。在本文中，线性经过两种测试办法进行量化：
（a）可变荧光染料浓度
（b）可变透光率
为了评定设备性能的变化，进行了多次揭发连续时间的测绘。最平常的量化线性的办法是运用包含从小于检测限（LOD）到最大生物学关联水平的荧光染料溶液的多孔模型。
用于表征系统线性的第二种办法触及在宽视场模型上安置中性密度（ND）滤光片，这与多孔模型办法同样供给区别水平的检测光强度。之前的科研中运用了基于ND滤光片的办法来确定结合光学相干断层扫描和自发荧光（OCT-AF）影像系统的线性。这种办法的原理和实验设计如下图所示。原则上，在NIR光经过ND滤光片传输两次（T2）后收集发射的荧光信号。运用宽视场模型协同中心有孔的黑色塑料片（相当于中性密度滤光片直径约0.5"）和ND滤光片（OD：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0、2.0、3.0和4.0）来覆盖光圈。而后对每一个滤光片进行1秒揭发的图像捕捉。另外，运用UV-VIS光谱仪单独校准每一个滤光片的透光率。
(a) 基于可变透光率评定灵敏度的设置示意图
(b) 宽视场模型
(c) 覆盖有黑色材料的宽视场模型
评估线性的两个关联构成部分是线性关系的浓度范围和在该范围内线性拟合的质量。报告这两个指标可供给对设备性能的全面见解。回归起点应设在最低强度（如LOD），并包括最少五个浓度点。随后添加数据点，并在R²值不小于0.98的状况下重复线性回归分析。对比区别数据集的拟合值，报告最佳R²值。
◈ 穿透深度
许多科研探讨了荧光包括深度怎样影响强度和表观尺寸。这类测试针对估计经过组织检测生物结构的厚度，以及深度对评定形态学能力的影响非常重要。在本测试中，咱们运用了3D打印多通道模型。记录每一个深度的荧光图像，并量化以下三个指标：全宽半高（FWHM）、对比噪声比（CNR）和穿透深度限制。经过水平剖面图分析FWHM，计算CNR，并应用Rose准则（CNR > 5）确定可检测极限。
其中，SA=通道中的平均信号强度；SB=背景中的平均信号强度；σ0=背景的标准偏差。
穿透深度模型的近红外荧光图像说明 (a) 估算对比度-噪声比的方法；(b) 取样区域的尺寸；以及 (c) 半最大全宽取样区域。
◈ 信号均匀性
评定图像均匀性有助于确定设备在多大程度上准确再现荧光分布。不均匀的影像可能会限制可用的视野，并改变读取者对图像中特征和趋势的感知。另外，它还可能对其他图像质量特性（如空间分辨率）产生有害影响。准确的均匀性测试能够供给数据以执行图像场强度校正。信号强度在图像场中的变化一般是因为样品表面照明光的径向变化，尽管检测路径中的非理想行径（如渐晕）亦可能有明显贡献。
为了全面评定信号均匀性，咱们运用了宽视场模型。记录、绘制并定量分析水平和垂直剖面图中的强度变化。
◈ 激发光串扰
激发光进入检测路径是荧光影像系统中的平常伪影，因为光谱过滤不充分或恶化，以及需要在接近激发波段的波长处检测荧光。多种文献对“串扰”效应进行了评定。在本科研中，对多孔模型进行了以下测绘：
（a）快门关闭
（b）仅有高散射（µs约为20cm−1，800nm）的孔
（c）含生物关联ICG浓度的孔。
表中汇总了每一个图像质量特性的指标、模型和关联文献。
3 | 结果与讨论
空间分辨率
最佳焦点的CTF曲线分别绘制了水平和垂直方向，并运用三次多项式进行拟合，供给了高质量的暗示（R²=0.99）。而后应用Rayleigh准则确定影像系统的空间分辨率。水平和垂直CTF曲线非常类似，但分辨率值略有区别，分别为0.31mm（3.2 lp/mm）和0.29mm（3.5 lp/mm）。
尽管咱们的办法比运用L形荧光条带的办法更繁杂和费时，但它是一种更广泛理解的标准办法，易于运用商场目的实现。咱们的办法更适合于偶尔的、严格的性能表征，而紧凑的多特征模型可能更适合平常测试。
空间分辨率结果以对比度传递函数的形式呈现，分别为(a)水平方向和(b 垂直方向。
景深（DOF）
景深测绘供给了关于图像分辨率对设备-目的距离变化敏锐性的见解。结果表示，当模型从18mm外的位置向最佳焦点移动时，全部空间频率范围内的对比度逐步增多，而后在模型经过焦平面后再次减少。这显示非平面表面在焦平面上下约1cm的变化可能会影响分辨率。
运用Rayleigh准则直接从测绘结果估算的分辨率值，以及运用三次多项式拟合CTF曲线确定的值显示，Rayleigh准则办法是探索景深的更可重复和靠谱的办法。
景深结果表示了在七个位置（垂直方向）的对比度传递函数。
下图表示了按照测绘结果直接估算的Rayleigh分辨率值以及经过三阶多项式拟合的CTF曲线确定的值[见下图(b)]。文中还展示了一种替代的、更简单的办法，即在相机与目的距离变化时，对单组条纹在2.0 lp/mm空间频率下的对比度进行测绘。虽然单一频率分辨率目的办法更简单，但它在表示聚焦区域和失焦区域之间的区别时不足显著。在评定的技术中，基于Rayleigh准则的办法是探索景深时更可重复和靠谱的办法。
基于区别办法的景深结果：(a) Rayleigh准则（未拟合），(b) 三阶多项式拟合，以及(c) 垂直方向2 lp/mm空间频率的对比度结果，及其相应的水平方向结果(d)–(f)。2 lp/mm图像的示例集表示在(g)中。
灵敏度
对每种ICG浓度（0.008µM~52µM）在三种揭发时间（100、500和1000ms）下的图像进行归一化。荧光强度随着ICG浓度的增多而成比例增多，直到某个浓度范围为止。例如，在1000ms揭发下，荧光强度在26µM之前表示出线性趋势，之后曲线的斜率减小。
单独峰值归一化的吲哚菁绿掺杂环氧树脂孔的图像，分别在三种揭发时间（100、500和1000ms）下获取。
ICG掺杂环氧树脂多孔模型中的平均荧光强度(a)和信噪比(b)的结果。表示了平均测绘值(n=3)，但标准偏差不足以表示误差条。
SNR做为浓度的函数进一步用于量化检测限（LOD）和定量限（LOQ）。按照ICH指南，LOD定义为SNR=3时的浓度，LOQ定义为SNR=10时的浓度。咱们在分析中遵循这些定义。
ICG 掺杂灵敏度模型中 LOD 和 LOQ 的结果
信号线性
多孔模型和ND滤光片办法均表示出良好的线性（R²=0.98-0.99），前提是上限浓度设置为13µM。ND滤光片办法供给了一个有用的弥补见解，尽管它不可直接反映荧光剂的非线性或检测限。
(a) 灰度近红外荧光图像与 OD 值的函数关系；
(b) 单独归一化的假色图像；
(c) 结果图解分析及线性回归拟合。
穿透深度
咱们经过多通道模型的图像生成为了信号强度和包括物宽度的定量数据。结果显示，CNR随深度快速下降，8mm深度后的荧光图像变得模糊，但仍能够区分通道区域。按照Rose准则（CNR>5），多通道模型的穿透深度限制为12mm。
(a）多通道模型的单独归一化图像，以及通道模型的定量分析，包含（b）信噪比和（c）表观通道宽度与深度的函数关系。
多通道显像管的对比噪声与深度的函数关系。
信号均匀性
咱们经过在宽视场模型的多个位置获取图像，确定模型本身拥有高度均匀性，径向强度变化重点来自照明光源。信号均匀性从图像中心到边缘变化43%至51%。
均匀性经过二维空间分布以及水平和垂直剖面来进行说明。
激发光串扰
激发光串扰测绘结果显示，尽管存在少量激发光泄漏，但相针对生物关联ICG浓度的信号，这一水平较低。详细而言，串扰水平为背景噪声的84倍，而生物关联信号则高出31倍。
激发光泄漏测绘结果，包含以下状况：
(a) 快门关闭
(b) 无荧光的环氧树脂模型，散射系数µs=20cm⁻¹
(c) 含有生物学关联浓度的吲哚菁绿（3.2µM）的环氧树脂模型。
4 | 结论
基于医学和荧光影像文献中的多种办法，咱们研发并展示了一套评定宽视场成像仪中荧光图像质量的综合测试办法。本文处理了以下性能特性：空间分辨率、景深（DOF）、灵敏度、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、穿透深度、视场（FOV）、均匀性、对比度细节分析和激发光泄漏。咱们还提出了有些关键指标，这些指标能够促进设备性能的直接定量比较。
另外，以上几种测试办法能够稍作修改（例如运用色素代替荧光剂），以用于新兴的模式，如光声断层影像/显微镜和空间频率域影像。这些办法有可能比一般实现的更统一地评定和比较临床和临床前影像系统，其长时间目的是创立荧光图像质量评定的国际标准。
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本文内容梳理自Med. Phys., 47: 3389-3401，作者：Udayakumar Kanniyappan，Bohan Wang, Charles Yang，Pejman Ghassemi, Quanzeng Wang, T. Joshua Pfefer，Maritoni Litorja，Nitin Suresh
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发表于 2024-10-10 11:30:23