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类C1q蛋白3（C1q-LP3）在蛋白质组学科研中被鉴定为一种在虹鳟鱼和大西洋鲑鱼血液中在细菌感染时期增多的蛋白质（参考文献1）。健康鱼的水平约为0.1 µg/ml，感染时期可增多至70 µg/ml。
艾美捷Life Diagnostics鳟鱼C1q-LP3 ELISA试剂盒检测原理：
该检测运用针对重组虹鳟鱼C1Q-LP3产生的多克隆抗体。它能够识别虹鳟鱼和大西洋鲑鱼的C1qLP3。未结合的抗体被包被在微孔板的孔中并用于捕捉。辣根过氧化物酶（HRP）结合物用于检测。标准品和稀释样品（100 µl）在包被有抗体的微孔中孵育45分钟。洗涤孔后，加入HRP结合物（100 µl）并孵育45分钟。倘若存在C1q-LP3分子，它们会被夹在捕捉抗体和检测抗体之间形成夹心。而后洗涤孔以去除未结合的HRP结合物。加入TMB并孵育20分钟。倘若存在C1q-LP3，会产生蓝色。经过加入终止溶液来停止颜色发展，颜色变为黄色。在450 nm处测绘吸光度。C1q-LP3的浓度与吸光度成正比，并经过标准曲线得出。
Life Diagnostics鳟鱼C1q-LP3 ELISA试剂盒材料和组分：
试剂盒供给的材料：
包被有抗C1q-LP3的板（12条8孔条）
HRP结合物，11毫升
C1q-LP3库存，1瓶，存放在-20°C
20倍洗涤溶液：TBS50-20，50毫升
稀释液：YD50-1，2瓶 x 50毫升
四甲基联苯胺（TMB）：TMB11-1，11毫升
终止溶液：SS11-1，11毫升
储存：
将标准品瓶存放在-20°C。试剂盒的其余部分应存放在4°C，微孔板应存放在带有干燥剂的密封袋中。试剂盒自购买之日起六个月内保持稳定。
通常说明：
运用前应让所有试剂达到室温。
当对说明有完整理解并遵守良好的实验室操作规范时，将得到靠谱和可重复的结果。
重要的是要快速将标准品和样品加入ELISA板中。倘若测试海量样品，意见不要从单独的管中将标准品和样品分装到ELISA板中，而是举荐以下办法：先将过量的标准品和样品分装到空白聚苯乙烯96孔板的孔中。而后运用8通道或12通道多道移液器快速将100 µl的等分转移到包被有抗体的板的孔中。
洗涤程序至关重要。洗涤不充分会引起精度差和吸光度读数虚高。
实验室温度会影响吸光度读数。该检测运用设置在150转/分钟和25°C的摇动孵育器进行校准。在较低的温度和混合速度下进行检测可能会引起吸光度值降低。
标准品准备：
1. 库存品为冻干状态。按照瓶签上表示的稀释液体积进行重构，并按描述准备100 ng/ml的标准品。
2. 标记七个聚丙烯试管，分别为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0 ng/ml。每一个试管中分装0.25 ml的稀释液。
3. 将0.25 ml的100 ng/ml C1q-LP3标准品移液到标记为50 ng/ml的试管中并混合。这便供给了50 ng/ml的C1q-LP3标准品。
4. 经过二倍系列稀释法，一样准备25至1.56 ng/ml的标准品。未运用重构后的C1q-LP3应存放在-20°C或更低温度下。
样品：
在Life Diagnostics的科研中，咱们发掘C1q-LP3的水平范围从0到超过70 µg/ml。必须经过实证来确定z佳的稀释比例。咱们意见z初以100倍稀释（2.5 µl的血清或血液与247.5 µl的稀释液混合）对样品进行评定。理想状况下，稀释应在聚苯乙烯96孔板中进行（未供给）。这准许运用8通道或12通道多道移液器快速容易地将稀释后的样品转移到包被有抗体的板上。
程序：
1. 在盒式载体中固定所需数量的8孔条。未运用的条应存放在带有干燥剂的密封袋中，置于4°C。
2. 向孔中分装100 µl的标准品和样品。
3. 在25°C下，以150转/分钟的速率在板式摇床上孵育45分钟。
4. 运用板式洗涤器（每孔400 µl），用1倍洗涤液洗孔5次。
5. 向孔中分装100 µl的HRP结合物。
6. 在25°C下，以150转/分钟的速率在板式摇床上孵育45分钟。
7. 运用板式洗涤器（每孔400 µl），用1倍洗涤液洗孔5次。
8. 将孔猛击到吸水纸或纸巾上，以去除所有残留的液滴。
9. 向每一个孔中分装100 µl的TMB。
10. 在25°C下，以150转/分钟的速率在轨道式微孔板摇床上孵育20分钟。
11. 20分钟后，经过向每一个孔中加入100 µl的终止溶液来停止反应。
12. 轻轻混合。保证所有蓝色变为黄色非常重要。
13. 在5分钟内，运用板式阅读器测绘450 nm的吸光度。
结果：
1. 运用曲线拟合软件，经过将标准品的吸光度值与C1q-LP3浓度作图，构建标准曲线。
2. 运用绘图软件拟合标准曲线。咱们意见运用二阶多项式（二次）方程。
3. 推导样品中C1q-LP3的浓度。
4. 将推导出的浓度乘以稀释因子，以确定样品中的浓度。
5. 倘若样品的吸光度值超出标准曲线范围，应适当稀释样品并重新测试。
文献参考：
1. Marancik D, Gao G, Paneru B, Ma H, Hernandez AG, Salem M, Yao J, Palti Y and Wiens GD. Whole-body transcriptome of selectively bred,resistant-, control-, and susceptible-line rainbow trout following experimental challenge with Flavobacterium psycrophilum. Frontiers in GeneticsVolume 5, Article 453 (2015). https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00453
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发表于 2024-10-10 14:06:48
